Детство Евстигнеева прошло в посёлке имени Володарского. Его отец был на двадцать лет старше матери. Оба они были рабочими: Александр Михайлович — металлург, Мария Ивановна — фрезеровщица. Женя в шесть лет, остался без отца, мать второй раз вышла замуж, но и отчим умер, когда мальчику было семнадцать. До Великой Отечественной войны Евстигнеев успел окончить семилетку и в 1941 году пошёл работать электромонтёром. Потом год проучился в дизелестроительном техникуме, после смерти отчима четыре года работал слесарем на заводе «Красная Этна», занимался в самодеятельности, играл джаз.

Евстигнеев был очень музыкален, виртуозно играл на разных инструментах: на гитаре, на рояле, на вилках. Выступал в разных местах.

В 1946 году был зачислен на первый курс Горьковского театрального училища. Окончив его в 1951 году, был распределён во Владимирский областной драматический театр имени А. Луначарского.

В 1954 году поступил в Школу-студию МХАТ, сразу на второй курс. В середине 1955 года студенты Школы-студии МХАТ создали «Студию молодых актёров», которая через год стала базой для нового столичного театра — «Современник».

В 1956 году окончил Школу-студию МХАТ (курс П. В. Массальского), в школу-студию его забрал сам её ректор Радомысленский.

В 1960 году вступил в КПСС.

Первую свою значительную роль в «Современнике» Евстигнеев сыграл в 1960 году в спектакле «Голый король» по пьесе Евгения Шварца. После этого спектакля исполнитель главной роли — короля — Евстигнеев проснулся знаменитым.

В 1964 году сыграл роль Дынина в фильме режиссёра Элема Климова «Добро пожаловать, или Посторонним вход воспрещён».

Последней ролью Евстигнеева в «Современнике» был Дорн в «Чайке» А. П. Чехова в 1970 году.

В 1971 году вслед за Олегом Ефремовым перешёл в труппу МХАТа. Первой его ролью на новой сцене стал Володя в спектакле «Валентин и Валентина» по пьесе Михаила Рощина. В декабре 1980 года у Евстигнеева случился инфаркт. На рубеже 1990-х годов он сыграл в Театре Антона Чехова Фирса в «Вишнёвом саде», в 1991 году — в АРТели АРТИСТОВ Сергея Юрского — Глова в спектакле «Игроки-XXI». Последней ролью Евстигнеева в кино был царь Иван Грозный в фильме В. Ускова и В. Краснопольского «Ермак».

В 1988 году году сыграл профессора Преображенского в телефильме «Собачье сердце».

Скончался перед операцией на сердце в Лондоне 4 марта 1992 года (по другим источникам — 5 марта).

Похоронен в Москве на Новодевичьем кладбище (участок № 10).